Công nghệ chỉnh sửa gen là một phát minh mang tính đột phá trong lĩnh vực công nghệ sinh học, cho phép các nhà khoa học chỉnh sửa mật mã di truyền của sinh vật chính xác theo ý muốn. Chính vì vậy, giải Nobel Hóa học năm 2020 đã được trao cho hai nhà khoa học nữ là Emmanuelle Charpentier và Jennifer Doudna cho công nghệ chỉnh sửa CRISPR-Cas9. Đây là sự công nhận to lớn đối với tính đột phá và tiềm năng ứng dụng vượt trội của công nghệ này, mở ra kỷ nguyên mới trong y học, nông nghiệp và sinh học, đồng thời mang lại hy vọng cho những tiến bộ chưa từng có trong việc điều trị các bệnh di truyền và cải thiện giống cây trồng.
Công nghệ chỉnh sửa gen dựa trên CRISPR-Cas thế hệ đầu
Từ những nghiên cứu ban đầu về hệ miễn dịch của vi khuẩn dựa trên CRISPR-Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein (Cas)) để chống lại thực khuẩn thể, các phương pháp chỉnh sửa gen nhờ CRISPR-Cas truyền thống dựa vào việc tạo ra các vết đứt gãy sợi đôi của DNA (double-stranded break, DSB) của enzym Cas, dẫn hướng bởi các RNA dẫn (guide RNA-sgRNA/crRNA) tại các vị trí cụ thể trong bộ gen và sau đó DSB được sửa chữa thông qua các con đường tự sửa chữa DNA nội sinh của tế bào (Hình 1) (Jinek et al., 2012). Các DSB được tạo ra bởi các enzyme Cas9 hoặc Cas12a thường được sửa chữa bằng đầu nối không tương đồng (nonhomologous end-joining) – cơ chế thường dẫn tới đột biến, hoặc bằng các cơ chế sửa chữa dựa trên sự tương đồng (homologous recombination – HR) để sao chép thông tin di truyền từ các đoạn DNA cho (donor) có trình tự tương đồng với hai đầu tiếp giáp DSB.
Các phương pháp chỉnh sửa gen đời đầu khá đơn giản, hiệu quả và góp phần thúc đẩy nghiên cứu cơ bản và ứng dụng nhiều lĩnh vực, tạo tiền đề cho sự phát triển của các liệu pháp gen đích và nhiều ứng dụng công nghệ sinh học khác. Tuy nhiên, các công cụ chỉnh sửa gen dựa trên CRISPR-Cas đời đầu vẫn còn nhiều hạn chế bởi một số vấn đề như: tính đặc hiệu hay khả năng chỉnh sửa ngoài mục tiêu (off-target activity), phạm vi đích còn bị giới hạn bởi các vị trí nhận biết liền kề vùng bám của RNA dẫn (protospacer adjacent motif-PAM), sự phụ thuộc vào các cơ chế sửa chữa DSB nội sinh để thực hiện chỉnh sửa bộ gen cũng như việc chuyển các thành phần CRISPR-Cas vào tế bào bị giới hạn bởi các vector vận chuyển hoặc sinh vật đích (Van Vu et al. 2019; Pacesa et al. 2024).
Công nghệ chỉnh sửa gen dựa trên CRISPR-Cas thế hệ 2
Kể từ khi kỹ thuật chỉnh sửa gen lần đầu được giới thiệu, lĩnh vực này đã phát triển với tốc độ chưa từng có. Khả năng của các công cụ chỉnh sửa hệ gen đời đầu dựa trên các “kéo phân tử -molecular scissors” tạo ra DSB đã được cải tiến và đổi mới liên tục, không chỉ tăng cường tính đa dạng của các công cụ này mà còn tinh chỉnh độ chính xác của chúng. Những lo ngại về những tác động không mong muốn của DSB khi chúng được tạo ra ở vị trí ngoài đích và nhu cầu cải thiện hiệu quả của cơ chế sửa chữa thông qua cơ chế tái tổ hợp tương đồng (HR) hoặc tìm ra các công nghệ chỉnh sửa chính xác mới để thay thế công nghệ dựa trên HR đã thúc đẩy sự phát triển của các công nghệ CRISPR-Cas “thế hệ thứ hai”, không phụ thuộc vào việc tạo DSB và HR, đáng chú ý nhất là các công nghệ chỉnh sửa bazơ (Base Editor-BE) và chỉnh sửa nhờ mồi (Prime Editor-PE) (Hình 2). Hiện nay, với sự mở rộng của các công nghệ có sẵn sang cả hướng điều hòa biểu hiện gen và chỉnh sửa mRNA (Hình 2), lĩnh vực này cung cấp nhiều cách tiếp cận chỉnh sửa gen đa dạng và phù hợp hơn với từng yêu cầu và gen đích cụ thể (Anzalone et al. 2019).
Chỉnh sửa bazơ (Base Editing): Công nghệ này sử dụng enzym Cas9 bất hoạt (death Cas9-dCas9) hoặc mang đột biến điểm D10A để chỉ cắt một sợi DNA đích (nickase Cas9-nCas9(D10A)) kết hợp với một enzym có khả năng loại bỏ một nhóm amin (-NH2) của bazơ để chuyển đổi trực tiếp từng bazơ thành bazơ khác mà không cần tạo ra các DSB (Hình 2). Phương pháp này đặc biệt hiệu quả trong việc tạo ra các đột biến điểm cụ thể (từ A thành G hoặc từ C thành T, cũng như từ A thành C hoặc từ C thành G), cho phép chỉnh sửa gen chính xác hoặc đưa vào các codon kết thúc để bất hoạt gen (Gaudelli et al. 2017).
Chỉnh sửa nhờ mồi (Prime Editing): Công nghệ này kết hợp enzym Cas9 mang đột biến điểm H840A để chỉ cắt một sợi DNA (nickase Cas9 (H840A)-nCas9(H840A)) với enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase – RT) và sử dụng gRNA chỉnh sửa thông qua mồi (pegRNA) gồm một Cas9 sgRNA mang một đoạn RNA mã hóa thông tin cần chỉnh sửa phiên mã ngược (RT template-RTT) và một đoạn mồi ngắn (primer binding site-PBS) ở đầu 3’. Một điểm cắt trên sợi DNA không phải sợi đích (non-target strand) cho phép PBS bám vào sợi mang đầu 3’ có gốc -OH tự do làm kích hoạt quá trình phiên mã ngược trình tự RTT thành DNA bổ sung vào đầu 3’-OH đó nhờ enzym phiên mã ngược RT. Sau quá trình sao chép thông tin từ RTT, đoạn DNA bổ sung mang thông tin di truyền được thiết kế theo ý muốn có thể được tích hợp vào hệ gen của sinh vật thông qua các cơ chế sửa chữa DNA của tế bào (Hình 2 và 3). PE cho phép chèn, xóa và thay thế với độ chính xác cao các đoạn DNA ngắn lên đến vài chục nucleotide (Vu et al. 2024).
Các công cụ điều hòa phiên mã: Các công cụ này cho phép điều khiển phiên mã của gen được dẫn hướng bởi gRNA bằng cách sử dụng dCas9, chỉ có khả năng bám đặc hiệu mà không có khả năng cắt DNA, được hợp nhất với các tiểu phần protein có khả năng điều hòa phiên mã (như VP64 hoặc KRAB) để tác động lên các vùng có khả năng điều khiển quá trình phiên mã gen như các vùng khởi động gen hoặc vùng nằm trước điểm khởi đầu phiên mã uORF (Si et al. 2020).
Chỉnh sửa RNA: Khác với chỉnh sửa bộ gen, các công cụ chỉnh sửa RNA sử dụng các enzyme Cas13 nhắm vào RNA, hoặc để phân hủy bản sao mục tiêu (khi chúng có hoạt tính cắt RNA) hoặc chỉnh sửa mRNA (khi chúng bị bất hoạt và được hợp nhất với enzyme khử có khả năng loại bỏ gốc -NH2 của bazơ (Hình 2)).
Prime Editing – bước đột phá mới của công nghệ chỉnh sửa gen
Prime Editing là một phương pháp có độ chính xác cao để chỉnh sửa mã DNA. Nó lợi dụng khả năng tạo đứt gãy sợi đơn trên sợi DNA đối diện sợi mà gRNA bám của nCas9(H840A) và hoạt động sao chép ngược của enzym RT giúp sao chép thông tin di truyền mang trên đầu 3’ của pegRNA từ đoạn RTT vào đầu 3’-OH của sợi DNA đích đã bị đứt đó (Van Vu et al., 2019) (Hình 3). Sau khi phản ứng phiên mã ngược xảy ra, quá trình tích hợp thông tin di truyền vào sợi DNA đích có thể liên quan đến các con đường sửa chữa tổn thương DNA như cơ chế sửa chữa không khớp (mismatch repair-MMR) (Hình 3). Về lý thuyết, Prime Editing có thể thực hiện nhiều loại chỉnh sửa gen chính xác khác nhau, chẳng hạn như thay thế bazơ, chèn trình tự DNA, và xóa nhiều nucleotide. Hơn nữa, kỹ thuật này rất hiệu quả và chính xác ở thực vật (Lin et al. 2020; Gao 2021; Van Vu et al. 2022; Li et al. 2023; Vu et al., 2024b).
Công nghệ chỉnh sửa gen nhờ CRISPR-Cas thế hệ 3: Cuộc đua về tăng cường hiệu suất chỉnh sửa gen và chỉnh sửa các đoạn dài
Biên giới của công nghệ chỉnh sửa gen càng mở rộng. Các nhóm nghiên cứu trên thế giới đang tham gia vào cuộc đua tối ưu hóa các công cụ chỉnh sửa gen, không chỉ tăng cường hiệu suất chỉnh sửa gen mà còn nâng cao khả năng chỉnh sửa các đoạn gen dài với độ chính xác và hiệu quả cao hơn trong khi giảm thiểu các sai lệch không mong muốn.
Các thành tựu trong việc cải tiến độ chính xác chỉnh sửa gen đã đạt được nhờ sự phát triển các biến thể cải tiến của Cas9 như eSpCas9 và HiFi Cas9 giúp tăng độ chính xác bằng cách giảm thiểu các lỗi ngoài mục tiêu, giúp chỉnh sửa gen với độ chính xác cao hơn trong các tế bào động vật và thực vật. Ngoài ra, thông qua Cas13 thì công nghệ chỉnh sửa không chỉ giới hạn ở DNA mà còn mở rộng đến RNA, giúp gia tăng hiệu suất chỉnh sửa và giảm các vấn đề tiềm tàng liên quan đến DNA (Pacesa et al. 2024).
Thêm nữa,khả năng chỉnh sửa các đoạn gen dài là một bước tiến lớn trong việc chỉnh sửa gen, đặc biệt là đối với các gen lớn hoặc các vùng quan trọng trong hệ gen của sinh vật. Prime Editing không chỉ giới hạn ở việc thay đổi một vài bazơ nucleotide mà còn có thể chèn hoặc xóa các đoạn DNA dài. Nhóm nghiên cứu của David Liu đã chứng minh rằng kỹ thuật này có thể thay thế một đoạn DNA dài lên đến 80 base một cách chính xác, vượt xa các khả năng của CRISPR truyền thống (Anzalone et al. 2020).
Khả năng ứng dụng công nghệ Prime Editing cũng đã được mở rộng sang hướng giúp chèn chính xác các gen hay alen có kích thước vài kb nhờ sự kết hợp với các protein tái tổ hợp DNA (recombinase) bằng một công nghệ có tên là prime-editing-assisted site-specific integrase gene editing (PASSIGE) (Anzalone et al., 2022). PASSIGE có thể giúp phục hồi các gen di truyền đã bị bất hoạt gây các bệnh hiểm nghèo ở người: ví dụ, hơn 500 biến thể gen ABCA4, 1.000 PAH và 2.000 CFTR đã được báo cáo ở những bệnh nhân mắc bệnh Stargardt, phenylketon niệu và xơ nang tương ứng (Pandey et al., 2024). Lợi thế của PASSIGE là có thể giúp chèn chính xác gen có kích thước lên tới hàng chục kb ở các vị trí an toàn (safe harbor site) trong hệ gen người để không gây ảnh hưởng tới các gen khác như các phương pháp liệu pháp gen (gene therapy) thông qua vector virus hoặc chèn ngẫu nhiên gen. Trong khi đó, liệu pháp gen truyền thống lại có nguy cơ gây ảnh hưởng tới các gen khác và thậm chí là gen gây ung thư (oncogene) khi chèn ngẫu nhiên vào hệ gen.
Ở thực vật, Caixia Gao và cộng sự đã ứng dụng công nghệ tương tự PASSIGE, được đặt tên là PrimeRoot, để chèn gen giúp kháng bệnh đạo ôn vào vị trí an toàn trong hệ gen lúa và tạo được dòng lúa kháng bệnh đạo ôn (Sun et al. 2024). Về cơ bản, công nghệ PrimeRoot sử dụng công cụ Prime Editing để chèn chính xác các đoạn DNA tái tổ hợp (recombinase sequence, như lox66) vào vị trí mong muốn và các gen được chèn vào vị trí đó thông qua cơ chế tái tổ hợp với các đoạn DNA cho (donor DNA) mang các gen cần chèn và các đoạn mã tái tổ hợp tương ứng (lox71). Quá trình tái tổ hợp được thực hiện các enzym tái tổ hợp như Cre recombinase (Hình 4) (Vu et al., 2024a). Công nghệ PrimeRoot mang lại hướng đột phá trong các nghiên cứu ứng dụng của ngành sinh học tổng hợp (synthetic biology) giúp tạo cây mang các gen ngoại lai được chèn chính xác ở vị trí mong muốn, do đó có thể giúp loại bỏ tính bất định trong quá trình biểu hiện gen bởi cơ chế bất hoạt gen (gene silencing) do gen bị chèn ngẫu nhiên trong hệ gen cây trồng bằng phương pháp truyền thống. Từ đó chúng ta có thể ứng dụng trong tạo cây sản xuất vắc xin và các loại dược chất có lợi cho sức khỏe với biểu hiện ổn định và bền vững của gen chuyển.
Lời kết
Trong lĩnh vực nông nghiệp, công nghệ chỉnh sửa gen đang trở thành một công cụ mạnh mẽ trong việc cải thiện cây trồng, đáp ứng các thách thức toàn cầu về an ninh lương thực và biến đổi khí hậu. Với những xu hướng hiện tại và sự phát triển không ngừng, chỉnh sửa gen chắc chắn sẽ đóng vai trò quan trọng trong tương lai của nông nghiệp. Những tiến bộ mới như Base Editing và Prime Editing hứa hẹn sẽ mang lại sự chính xác cao và giảm thiểu các rủi ro không mong muốn. Công nghệ chỉnh sửa gen đang được ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp để cải thiện các tính trạng mong muốn ở cây trồng, bao gồm: khả năng duy trì năng suất trong điều kiện khắc nghiệt của môi trường (tăng khả năng chống chịu với hạn hán, mặn và nhiệt độ cao, v.v.), tăng cường dinh dưỡng, kháng sâu bệnh hay giảm phát thải khí nhà kính hướng tới phát triển nông nghiệp xanh và bền vững. Công nghệ chỉnh sửa gen đã và đang được cải tiến và cải thiện liên tục với mục tiêu giúp chúng ta chỉnh sửa gen chính xác với hiệu quả cao ở mọi vị trí trong hệ gen, mọi kiểu chỉnh sửa, và mọi loại cây trồng.
Tác giả: 1.TS. Tô Thị Mai Hương, Trường Đại học Khoa học và Công nghệ Hà Nội – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2. TS. Vũ Văn Tiến, Trường Đại học Quốc gia Gyeongsang (Hàn Quốc).
Biên tập: Quỹ Đổi mới sáng tạo Vingroup (VinIF).
Ghi chú: Các hình vẽ trong bài được thiết kế bởi BioRender©
Tài liệu tham khảo
1. Anzalone A V., Koblan LW, and Liu DR. Genome editing with CRISPR–Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. Nat Biotechnol. 2020:38(7):824–844. https://doi.org/10.1038/s41587-020-0561-9
2. Anzalone A V., Randolph PB, Davis JR, Sousa AA, Koblan LW, Levy JM, Chen PJ, Wilson C, Newby GA, Raguram A, et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature. 2019:576(7785):149–157. https://doi.org/10.1038/s41586-019-1711-4
3. Anzalone, A. V. et al (2022) Programmable deletion, replacement, integration and inversion of large DNA sequences with twin prime editing. Nat. Biotechnol 40, 731–740.
4. Gao C. Genome engineering for crop improvement and future agriculture. Cell. 2021:184(6):1621–1635. https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.01.005
5. Gaudelli NM, Komor AC, Rees HA, Packer MS, Badran AH, Bryson DI, and Liu DR. Programmable base editing of T to G C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature. 2017:551(7681):464–471. https://doi.org/10.1038/nature24644
6. Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, and Charpentier E (2012). A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity.
7. Li J, Ding J, Zhu J, Xu R, Gu D, Liu X, Liang J, Qiu C, Wang H, Li M, et al. Prime editing-mediated precise knockin of protein tag sequences in the rice genome. Plant Commun. 2023:4(3). https://doi.org/10.1016/j.xplc.2023.100572
8. Lin Q, Zong Y, Xue C, Wang S, Jin S, Zhu Z, Wang Y, Anzalone A V., Raguram A, Doman JL, et al. Prime genome editing in rice and wheat. Nat Biotechnol. 2020:38(5):582–585. https://doi.org/10.1038/s41587-020-0455-x
9. Pacesa M, Pelea O, and Jinek M. Past, present, and future of CRISPR genome editing technologies. Cell. 2024:187(5):1076–1100. https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.01.042
10. Pandey, S., Gao, X.D., Krasnow, N.A. et al (2024) Efficient site-specific integration of large genes in mammalian cells via continuously evolved recombinases and prime editing. Nat. Biomed. Eng. https://doi.org/10.1038/s41551-024-01227-1
11. Si X, Zhang H, Wang Y, Chen K, and Gao C. Manipulating gene translation in plants by CRISPR–Cas9-mediated genome editing of upstream open reading frames. Nat Protoc. 2020:15(2):338–363. https://doi.org/10.1038/s41596-019-0238-3
12. Sun C, Lei Y, Li B, Gao Q, Li Y, Cao W, Yang C, Li H, Wang Z, Li Y, et al. Precise integration of large DNA sequences in plant genomes using PrimeRoot editors. Nat Biotechnol. 2024:42(2):316–327. https://doi.org/10.1038/s41587-023-01769-w
13. Vu T V., Nguyen NT, Kim J, Hong JC, and Kim JY (2024a). Prime editing: Mechanism insight and recent applications in plants. Plant Biotechnol J. 2024:22(1):19–36. https://doi.org/10.1111/pbi.14188
14. Vu TV, Nguyen NT, Kim J, Song YJ, Nguyen TH, Kim JY (2024b) Optimized dicot prime editing enables heritable desired edits in tomato and Arabidopsis. Nat Plants. doi: 10.1038/s41477-024-01786-w. Epub ahead of print.
15. Van Vu T, Das S, Hensel G, and Kim JY. Genome editing and beyond: what does it mean for the future of plant breeding? Planta. 2022:255(6). https://doi.org/10.1007/s00425-022-03906-2
16. Van Vu T, Sung YW, Kim J, Doan DTH, Tran MT, and Kim JY. Challenges and Perspectives in Homology-Directed Gene Targeting in Monocot Plants. Rice. 2019:12(1). https://doi.org/10.1186/s12284-019-0355-1