Liệu pháp Gonadotropin, hormone tạo hoàng thể (LH), hormone kích thích nang trứng (FSH) và hormone gonadotropin màng đệm (CG), đóng vai trò thiết yếu trong các phương pháp điều trị vô sinh ở người hoặc kiểm soát sinh sản ở động vật. LH và FSH được tổng hợp ở các tuyến sinh dục của tuyến yên trước, trong khi CG được tổng hợp bởi nguyên bào nuôi hợp bào nhau thai. Việc đưa liệu pháp này vào ngành y tế có từ gần một thế kỷ trước và là một bước tiến lớn trong điều trị vô sinh. Các gonadotropin tự nhiên đã được sử dụng trong một thời gian dài trong điều trị vô sinh ở người như hFSH được tinh chế từ nước tiểu của phụ nữ mãn kinh; hCG được tinh chế từ nước tiểu của phụ nữ mang thai; ở động vật như eCG hay có tên gọi khác là PMSG được tinh chế từ huyết thanh ngựa chửa; FSH lợn được tinh chế từ tuyến yên thu được tại các lò giết mổ. Tuy nhiên vì lý do vệ sinh và đạo đức, việc sử dụng các gonadotropin tự nhiên ngày càng trở nên khó khăn hơn trong điều trị vô sinh ở người hoặc kiểm soát sinh sản ở động vật.
Những nỗ lực đã được thực hiện để cải thiện các chế phẩm gonadotropin trong thế kỷ qua, đặc biệt là với việc sản xuất gonadotropin bằng các nguồn tài nguyên công nghệ sinh học. Một thành tựu lớn là đưa công nghệ tái tổ hợp vào quy trình sản xuất hormone kích thích nang trứng (FSH), hormone tạo hoàng thể (LH) và gonadotropin màng đệm (CG) ở người. Gonadotropin tái tổ hợp có hoạt tính đặc hiệu cao hơn so với các gonadotropin có nguồn gốc từ nước tiểu, do đó cho phép tiêm dưới da một lượng nhỏ glycoprotein. Gonadotropin công nghệ sinh học có hiệu quả và hiệu suất lâm sàng tốt hơn so với các sản phẩm từ nước tiểu, do sản xuất nhiều trứng hơn với một liều tiêm thấp. Số lượng trứng/phôi được sản xuất tăng lên sẽ tác động tích cực đến cơ hội thụ thai của bệnh nhân. Gonadotropin công nghệ sinh học cũng phù hợp với các chỉ số chất lượng quan trọng của việc chăm sóc vô sinh, bao gồm cả tính an toàn và lấy bệnh nhân làm trung tâm.
Cấu trúc của gonadotropin
Hormone gonadotropin là các protein liên kết cộng hóa trị với một carbohydrate (glycoprotein). Chúng bao gồm một tiểu đơn vị α phổ biến không liên kết cộng hóa trị với tiểu đơn vị β. Cấu trúc ba chiều và hình dạng hoạt động của các tiểu đơn vị được duy trì bởi các liên kết disulfide bên trong. Tiểu đơn vị α chứa 92 amino axit và giống hệt nhau trong FSH, LH và hCG. Ngược lại, các tiểu đơn vị β là riêng biệt và mang lại đặc tính thụ thể độc đáo cũng như các đặc tính sinh học và miễn dịch khác biệt. Bản thân các tiểu đơn vị protein không có hoạt tính sinh học; hoạt tính sinh học được tạo ra nhờ sự gắn kết của các nhóm carbohydrate tạo thành dị hợp tử.
Nhìn chung, glycosyl hóa protein đóng vai trò điều hòa rất quan trọng trong việc xác định hoạt động và chức năng của protein. Mức độ và kiểu glycosyl hóa truyền tải phổ điện tích, hoạt tính sinh học và thời gian bán hủy khác nhau của từng glycoprotein. Glycoprotein có hai kiểu glycosyl hóa cơ bản – liên kết O và liên kết N. Glycosyl hóa liên kết O được đặc trưng bởi sự gắn kết của carbohydrate N-acetylgalactosamine (GalNAc) với nhóm hydroxyl của một amino axit, serine hoặc threonine. Glycosyl hóa liên kết N liên quan đến sự gắn kết của N-acetyl glucosamine (GlcNAc) với nhóm amide của asparagine (Asn), mô tả như Hình 1.
Gonadotropin được biến đổi thêm trong cơ thể sống bằng cách thêm axit sialic (sialylation) hoặc nhóm sulfonic (sulfonation) vào các nhóm carbohydrate. Cả sialylation và sulfonation đều là các quá trình sinh lý có vai trò chính trong điều chỉnh hoạt động sinh học của gonadotropin. Các oligosacarit thường kết thúc bằng axit sialic và/hoặc GalNAc được liên kết với β1-4 (SO3-4GalNAc). Các phân tử có số lượng lớn Gal-NAcs được sulfon hóa sẽ biến mất khỏi tuần hoàn nhanh hơn so với các dạng đồng phân ít được sulfon hóa do chúng có ái lực với các thụ thể SO3-4GalNAc ở gan. Mặt khác, nhiều axit sialic trong cấu trúc sẽ nâng cao thời gian bán hủy.
Thời gian bán hủy của gonadotropin trong cơ thể sau khi tiêm phụ thuộc vào cấu trúc
Như đã đề cập ở trên, tiểu đơn vị α của các gonadotropin là giống hệt nhau trong hFSH, hLH và hCG và khác nhau ở tiểu đơn vị β. Một điểm khác biệt đáng chú ý là sự hiện diện của một đoạn đầu cuối cacboxylic dài với 24 amino axit chứa bốn vị trí oligosaccharide liên kết O trong cấu trúc của hCG, mô tả như Hình 1. Ngoài ra, tiểu đơn vị beta của hCG chứa hai vị trí glycosyl hóa liên kết N, so với một vị trí duy nhất trong LH. Do số lượng cả hai vị trí glycosyl hóa và các gốc axit sialic cao hơn (khoảng 20) so với LH, hCG tự nhiên có thời gian bán hủy cuối cùng dài hơn đáng kể là 24 giờ sau khi tiêm tĩnh mạch so với khoảng 30 phút đối với LH, như thể hiện trong Bảng 1.
Bảng 1. Đặc điểm cấu trúc của các phân tử FSH, LH và hCG tự nhiên
| Gonadotropin | Tiểu đơn vị α | Tiểu đơn vị β | glycosyl hóa liên kết N trên α | glycosyl hóa liên kết N trên β | glycosyl hóa liên kết O trên β | Đuôi CTP trên β | Thời gian bán hủy trong cơ thể sống (t½)* |
| FSH | 92AA | 111AA | 2 | 2 | – | Không | 3-4 giờ |
| LH | 92AA | 121AA | 2 | 1 | – | Không | 20-30 phút |
| hCG | 92AA | 145AA | 2 | 2 | ‘ | Có | 24 giờ |
AA: Axit amin; t½ = thời gian cần thiết để nồng độ trong huyết tương của một chất đạt tới một nửa giá trị trạng thái ổn định của nó; * Sau khi truyền tĩnh mạch
Gonadotropin huyết thanh ngựa mang thai (eCG) – công cụ bí ẩn nhưng thiết yếu trong hỗ trợ sinh sản động vật
Gonadotropin nhau thai ngựa (eCG) trước đây được gọi là gonadotropin huyết thanh ngựa mang thai (PMSG) thuộc họ hormone glycoprotein. Nó được sản xuất bởi các nguyên bào nuôi của các cốc nội mạc tử cung ở ngựa mang thai và đóng vai trò chính trong việc duy trì thai kỳ sớm. eCG cũng bao gồm hai tiểu đơn vị α và β không giống nhau và không liên kết cộng hóa trị (Hình 2). Đặc tính đặc biệt của eCG là kích thích cả hormone kích thích nang trứng (FSH) và hoạt động của LH ở các loài không phải ngựa. Cơ sở sinh học cho hoạt động kép này được cho là kết quả của sự hỗn loạn của các thụ thể FSH ở động vật có vú, truyền khả năng phản ứng với hormone giống LH ở ngựa này. Vai trò của eCG ở ngựa cái là kích thích thể vàng phụ để hỗ trợ tốt hơn cho thai kỳ sớm. Có rất nhiều ứng dụng cho eCG ở các loài thuần hóa, bao gồm kích thích dậy thì, đảo ngược động dục, rụng trứng nhiều và gần đây nhất là cải thiện khả năng sinh sản.
Một trong những đặc điểm nổi bật của eCG là thời gian tác dụng kéo dài. Khi tiêm vào chuột, eCG có thời gian bán thải vượt quá 5 giờ, trong khi ở cừu, giá trị này là 21 giờ. Ở gia súc, thời gian bán hủy biến mất được ước tính là 45,6 giờ. Cơ sở cho sự tồn tại này trong tuần hoàn là quá trình glycosyl hóa rộng rãi của phân tử, bao gồm khoảng 45% trọng lượng phân tử của nó. Cả hai chuỗi đều được glycosyl hóa tại các vị trí liên kết N và liên kết O và phần mở rộng đầu C của tiểu đơn vị β được glycosyl hóa mạnh (Hình 2). Chính quá trình glycosyl hóa liên kết N, trong đó các chuỗi carbohydrate chứa axit sialic, mang lại thời gian bán hủy dài. Glycan sulfat hóa (liên kết O) được gan nhận biết và nhanh chóng được thanh thải, trong khi glycopotein sialyat hóa vẫn tồn tại. Việc loại bỏ axit sialic khỏi eCG bằng cách xử lý neuraminidase làm giảm thời gian thanh thải và việc loại bỏ 80% thời gian này giảm xuống còn dưới 60 phút. Điều này không phải là bất biến, kiểu glycosyl hóa của eCG quyết định không chỉ sự tồn tại của nó trong huyết thanh mà còn cả hoạt động sinh học của nó trong mô đích.
Do các đặc tính sinh học của nó, eCG đã được sử dụng trong một thời gian dài trong các chương trình thụ tinh. Tuy nhiên, các chế phẩm thương mại của eCG được tinh chế một phần từ huyết thanh ngựa cái mang thai (PMSG) có thể chứa các chất tiềm ẩn nguy cơ ô nhiễm.
Vì vậy việc sản xuất với số lượng lớn một chất thay thế có hoạt tính sinh học cho eCG và các gonadotropin khác được sử dụng làm tác nhân điều trị là rất có ý nghĩa. Cho đến nay, chỉ có các gonadotropin tái tổ hợp được sản xuất trong tế bào động vật có vú đã được chứng minh là có hoạt tính sinh học trong cơ thể sống.
Sản xuất các gonadotropin chuỗi đơn để điều trị sinh sản
Trên cở sở cấu trúc tự nhiên của các gonadotropin đã chỉ ra rằng có thể hợp nhất hai tiểu đơn vị gonadotropin thông qua trình tự βCTP làm trình tự liên kết và để kích thích hoạt động hormone. βCTP này trở thành glycosyl hóa liên kết O trong quá trình tổng hợp glycoprotein và cung cấp cho phân tử một thời gian bán hủy lâu dài trong máu. Đây là một điểm tốt nhưng glycosyl hóa liên kết O thường khó thu được trong các dòng tế bào khác nhau. Hơn nữa, chúng gây ra sự không đồng nhất về điện tích và kích thước của các glycoprotein được sản xuất. Vì những lý do này, điều quan trọng là phải nghiên cứu để sản xuất các gonadotropin chuỗi đơn mà không có βCTP của nó nhưng vẫn đảm bảo được tính năng của một gonadotropin trong điều trị sinh sản ở người và động vật.
Dự án sản xuất các gonadotropin chuỗi đơn để điều trị sinh sản do PGS.TSKH. Nguyễn Thị Mộng Điệp làm chủ nhiệm, được Quỹ Đổi mới sáng tạo Vingroup (VinIF) tài trợ năm 2020, đã góp phần xử lý 2 vấn đề quan trọng, đó là:
I. Tổng hợp thành công hai loại hormone tái tổ hợp chuỗi đơn eCG dùng cho động vật và hFSH với một liều tiêm cho cả quá trình điều trị
1.1. Hormone huyết thanh gonadotropin ngựa mang thai chuỗi đơn (PMSG)
Mô tả: PMSG tái tổ hợp này là một dạng PMSG chuỗi đơn, được glycosyl hóa và có khả năng phản ứng trong nhiều hệ thống xét nghiệm dựa trên kháng thể. PMSG chuỗi đơn được sản xuất bằng Hệ thống biểu hiện expiCHO và được tinh chế bằng sắc ký cột. Nó được cung cấp dưới dạng bột, đông khô trong ammonium bicarbonate và hàm lượng protein được xác định bằng cách sử dụng Xét nghiệm Elisa sandwich. Protein này có khả năng bổ sung thay thế gonadotrophin kích thích nang trứng FSH và hormone kích thích tế bào kẽ của tuyến yên trước LH ở cả nam và nữ. Do đó PMSG kích thích sự phát triển của nang trứng ở phụ nữ.
- Thông tin sản phẩm:
Từ đồng nghĩa: PMSG, Huyết thanh Gonadotropin ngựa mang thai.
Loài: Ngựa.
Hệ thống biểu hiện: expiCHO.
Độ tinh khiết: >90% theo SDS-PAGE .
Protein dạng: Bột đông khô màu trắng đã lọc vô trùng.
MW: ~ 55 kDa.
Lưu trữ/Ổn định: Protein đông khô ổn định ít nhất 2 năm khi bảo quản ở -20°C. Sau khi hoàn nguyên, bảo quản ở 4°C tối đa một tháng hoặc ở -20°C tối đa sáu tháng. Tránh lặp đi lặp lại các chu kỳ đóng băng/tan băng.
Hoàn nguyên: Pha loãng trong nước cất hoặc nước muối sinh lý đến nồng độ 1000 IU/ml. Dung dịch này sau đó có thể được pha loãng vào các dung dịch đệm khác.
Nhiệt độ vận chuyển: Gói gel hoặc đá khô.
Cảnh báo: Tránh chu kỳ đóng băng/tan băng.
Chỉ định sử dụng: Chỉ sử dụng cho nghiên cứu trên động vật.
1.2. Hormone kích thích nang trứng chuỗi đơn ở người (hFSH)
- Mô tả: hFSH tái tổ hợp này là một dạng hFSH chuỗi đơn, được glycosyl hóa và có khả năng phản ứng trong nhiều hệ thống xét nghiệm dựa trên kháng thể. hFSH chuỗi đơn được sản xuất bằng Hệ thống biểu hiện expiCHO và được tinh chế bằng sắc ký cột. Nó được cung cấp dưới dạng bột, đông khô trong ammonium bicarbonate và hàm lượng protein được xác định bằng cách sử dụng Xét nghiệm Elisa sandwich.
- Thông tin sản phẩm
Từ đồng nghĩa: FSH, Hormone kích thích nang trứng, Follitropin
Loài: Người
Hệ thống biểu hiện: expiCHO
Độ tinh khiết: >90% theo SDS-PAGE
Protein dạng: Bột đông khô màu trắng đã lọc vô trùng
MW: ~ 50 kDa
Lưu trữ/Ổn định
Protein đông khô ổn định ít nhất 2 năm kể từ ngày nhận khi bảo quản ở -20°C. Sau khi hoàn nguyên, bảo quản ở 4°C tối đa một tháng hoặc ở -20°C tối đa sáu tháng. Tránh lặp đi lặp lại các chu kỳ đóng băng/tan băng.
Hoàn nguyên
Pha loãng trong nước cất hoạc nước muối sinh lý đến nồng độ không nhỏ hơn 0,1 mg/ml. Dung dịch này sau đó có thể được pha loãng vào các dung dịch đệm khác.
Nhiệt độ vận chuyển Gói gel hoặc đá khô
Cảnh báo Tránh chu kỳ đóng băng/tan băng
Chỉ định sử dụng Chỉ sử dụng cho nghiên cứu trên động vật
(II) Sản xuất và thử nghiệm trên động vật mang lại hiệu quả cao.
Hormone chuỗi đơn eCG và hFSH kích thích sự phát triển của uterus, ovary và gây siêu rụng trứng ở chuột Wistar Đài Loan và ICR Việt Nam, tăng sản xuất progesterone ở cừu (thử nghiệm được thực hiện tại INRAE, Viện Nghiên cứu Quốc gia Pháp về Nông nghiệp, Thực phẩm và Môi trường).
Dự án cung cấp nhiều thông tin khoa học hữu ích, đóng góp cho công nghệ hỗ trợ sinh sản động vật và con người. Điều này góp phần giúp xây dựng niềm tin vào việc sử dụng hormone tái tổ hợp trong công nghệ hỗ trợ sinh sản động vật và con người. Hơn nữa, việc thiết kế trình tự linker hợp nhất 2 tiểu đơn vị của hormone gonadotropin eCG và hFSH có thể mở ra hướng nghiên cứu mới về điều chế các loại hormone gonadotropin khác, góp phần nâng cao về hiệu quả sử dụng hormone tái tổ hợp trong công nghệ hỗ trợ sinh sản nói riêng và trong điều trị các bệnh lý liên quan đến nội tiết nói chung.
Khả năng tự sản xuất và mang lại hiệu quả kinh tế cho Việt Nam
Việt Nam, hiện chưa có cơ sở sản xuất hormone gonadotropin tái tổ hợp, nên ngành chăn nuôi thú y phải nhập khẩu dược phẩm thú y từ thị trường nước ngoài. Để giải quyết bài toán nhập khẩu dược phẩm thú y, không phụ thuộc vào nguồn cung từ thị trường nước ngoài và chủ động được việc cung cấp hormone hỗ trợ sinh sản cho vật nuôi tại thị trường trong nước và xuất khẩu ra nước ngoài thì việc thu hút doanh nghiệp, chủ đầu tư thành lập các cơ sở sản xuất dược phẩm thú y là hướng đi phù hợp với Việt Nam trong giai đoạn tới, bởi công nghệ tổng hợp hormone eCG và hFSH chuỗi đơn này đã được nhóm nghiên cứu chủ động trong sản xuất thử nghiệm.
Theo báo cáo, thị trường thuốc tiêm Equine Chorionic Gonadotropin (eCG) toàn cầu trị giá 257 triệu USD trong năm 2023 và dự kiến sẽ đạt 356 triệu USD vào năm 2030, dự báo tốc độ CAGR là 4,8% trong giai đoạn 2024 – 2030. Thị trường hormone kích thích nang trứng (hFSH) được ước tính đạt 3,4 tỷ USD vào năm 2033, tăng trưởng với tốc độ CAGR là 5,9% trong giai đoạn 2024 – 2033.
Các công ty dược phẩm lớn liên quan đến sinh sản của người đã phát triển việc sản xuất các loại hFSH hoang dã tái tổ hợp từ nuôi cấy tế bào động vật có vú hiện đang được sử dụng trong điều trị vô sinh ở người. Các hFSH tái tổ hợp được bán trên thị trường cho đến nay là các hFSH hoang dã tái tổ hợp có cấu trúc heterodimeric ngoại trừ phân tử Elonva là một phân tử hFSH có tên corifollitropin, chứa một hCGβCTP tại C terminus của tiểu đơn vị β. Điều này có nghĩa là hai tiểu đơn vị phải được đồng nhất và giảm thiểu không tương đồng đúng cách trước khi tiết ra từ tế bào.
Các công ty dược phẩm thú y chưa ra mắt gonadotropin tái tổ hợp nên trên thị trường hiện nay không có sẵn eCGs tái tổ hợp. Hormon tự nhiên, được gọi là PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotropin), phần lớn được sử dụng trong chăn nuôi gia súc (gia súc, lợn, cừu, dê) nhưng gần đây đã bị tranh cãi vì nó đòi hỏi phải lấy máu liên tục và vi phạm quy định về sức khỏe động vật ở nhiều nước. Do đó, điều quan trọng và rất cần thiết hiện nay là sản xuất eCG tái tổ hợp có sẵn cho thị trường chăn nuôi.
Hướng phát triển trong thời gian tới: điều quan trọng và rất cần thiết hiện nay là sản xuất eCG tái tổ hợp có sẵn cho thị trường chăn nuôi. Trước hết, dự án chúng tôi kêu gọi các tổ chức, doanh nhân trong và ngoài nước đầu tư “Nhà máy sản xuất hormone gonadotropin tiêm 1 liều cho toàn bộ quá trình hỗ trợ sinh sản” tạiViệt Nam để không còn phụ thuộc vào nguồn hormone nước ngoài. Sau đó, Dự án tiếp tục thử nghiệm trên động vật có vú khác và đặc biệt xin cấp phép thử nghiệm lâm sàng trên người đối với hFSH chuỗi đơn để có thể tiến tới sản xuất hormone trong điều trị vô sinh ở người.
Tác giả: PGS.TSKH. Nguyễn Thị Mộng Điệp, Trường Đại học Quy Nhơn.
Biên tập: Quỹ Đổi mới sáng tạo Vingroup (VinIF).
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Ulloa-Aguirre A, Dias JA, Bousfield GR. (2017). Gonadotropins. In: Simoni, M., Huhtaniemi, I. (eds) Endocrinology of the Testis and Male Reproduction. Endocrinology. Springer, Cham. DOI: 10.1007/978-3-319-29456-8_3-1.
Thi Mong Diep Nguyen, Danièle Klett, Yves Combarnous. (2023). Undissociable chemically cross-linked and single-chain gonadotropins. Theriogenology, Theriogenology 198, 250-255, DOI: 10.1016/j.theriogenology.2022.12.034.
Duong Tien Thach, Bui Khac Cuong, Hoang Van Tong, Vo Van Chi, Ngo Kim Khue, Nguyen Thi Phuong Hien, Nong Van Hai, Yves Combarnous, Thi Mong Diep Nguyen. (2022). Natural and recombinant equine Chorionic Gonadotropins past and future in animal reproductive technology. Veterinary Integrative Sciences 2022; 20(3): 751 – 760 DOI; 10.12982/VIS.2022.057.
Leão Rde B, Esteves SC. (2014). Gonadotropin therapy in assisted reproduction: an evolutionary perspective from biologics to biotech. Clinics (Sao Paulo, Brazil), 69(4):279-293. DOI: 10.6061/clinics/2014(04)10.
Murphy BD. (2012). Equine chorionic gonadotropin: an enigmatic but essential tool. Anim Reprod, 9(3), 223-230.